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线粒体是真核生物进行氧化代谢的地方，也是糖、脂肪、氨基酸最终被氧化释放能量的地方。线粒体通过三羧酸循环和氧化磷酸化负责最终氧化，分别对应有氧呼吸的第二和第三阶段。在细胞质基质中完成的糖酵解和在线粒体基质中完成的三羧酸循环会产生还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和还原型黄素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)等高能分子，氧化磷酸化的作用是利用这些物质还原氧并释放能量合成ATP。有氧呼吸时，1分子葡萄糖通过糖酵解、三羧酸循环和氧化磷酸化释放能量后可产生30-32分子ATP(考虑到可能需要2分子ATP才能将NADH转运到线粒体中)。如果细胞所处的环境缺氧，就会转向无氧呼吸。此时，糖酵解产生的丙酮酸不再进入线粒体中的三羧酸循环，而是继续在细胞质基质中反应(被NADH还原为乙醇或乳酸等发酵产物)，但不产生ATP。所以无氧呼吸时，一分子葡萄糖在第一阶段只能产生两分子ATP。
三羧酸循环
糖酵解中产生的每一个丙酮酸分子都会被积极地转运穿过线粒体膜。进入线粒体基质后，丙酮酸会被氧化并与辅酶a结合，生成CO2、还原型辅酶a和乙酰辅酶a..乙酰辅酶a是三羧酸循环(又称“柠檬酸循环”或“克雷布斯循环”)的初级底物。除了位于线粒体内膜的琥珀酸脱氢酶外，参与这一循环的酶都游离于线粒体基质中。在三羧酸循环中，乙酰辅酶a的每一个分子都被氧化，同时会产生一个还原辅因子(包括3个分子的NADH和1个分子的FADH2)和1个分子的初始电子传递链的三磷酸鸟苷(GTP)。
氧化磷酸化
还原性分子如NADH和FADH2(在细胞质基质中
in的还原当量可以从反向转运蛋白组成的苹果酸-天冬氨酸穿梭系统或通过甘油磷酸穿梭进入电子传递链。)经过电子传递链中的几个反应，氧气最终被还原，释放出能量，其中一部分用来生成ATP，剩下的以热能的形式耗散掉。线粒体内膜上的酶复合物(NADH-泛醌还原酶、泛醌-细胞色素c还原酶、细胞色素c氧化酶)利用过程中释放的能量，将质子以反向浓度梯度泵入线粒体膜的间隙。虽然这一过程是高效的，但仍有少数电子会过早地还原氧并形成活性氧(ROS)如超氧化物，这会引起氧化应激并降低线粒体性能。
当质子被泵入线粒体膜的缝隙时，在线粒体内膜两侧建立了一个电化学梯度，质子倾向于沿着浓度梯度扩散。质子的唯一扩散通道是ATP合酶(呼吸链复合体V)。当质子通过复合物从膜间隙返回线粒体基质时，电势能量被ATP合酶利用，由ADP和磷酸合成ATP。这个过程称为“化学渗透”，是一种辅助扩散。彼得·米切尔因提出这一假设而获得了1978年的诺贝尔奖。1997年，诺贝尔奖获得者保罗·博耶和约翰·瓦克阐明了ATP合酶的机制。
储存钙离子
线粒体可以储存钙离子，并与内质网、细胞外基质等结构协同控制细胞内钙离子浓度的动态平衡。线粒体快速吸收钙离子的能力使其成为细胞中钙离子的缓冲区。在线粒体膜电位的驱动下，钙离子可以通过存在于线粒体膜中的单向载体转运到线粒体基质中；线粒体基质排泄时，需要钠钙交换蛋白或钙诱导钙释放(CICR)机制的协助。当钙离子释放时，会引起“钙波”，并伴有膜电位的较大变化，可激活一些第二信使系统蛋白质，协调突触中神经递质的释放和内分泌细胞中激素的分泌。线粒体还参与细胞凋亡过程中的钙信号转导。
线粒体除了合成ATP为细胞提供能量的主要功能外，还承担许多其他生理功能。
调节膜电位，控制细胞程序性死亡:当线粒体内膜与外膜接触部位形成由己糖激酶(细胞质基质蛋白)、外周苯二氮卓受体、电压依赖性阴离子通道(线粒体外膜蛋白)、肌酸激酶(线粒体膜间隙蛋白)、ADP-ATP载体(线粒体内膜蛋白)和亲环素D(线粒体基质蛋白)组成的通透性转换孔(PT孔)时，形成通透性转换孔(PT孔)。线粒体膜通透性的增加还可以将凋亡诱导因子(AIF)等分子释放到细胞质基质中，破坏细胞结构。
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